Trong bài viết này, tôi sẽ trình bày chi tiết về quy trình PCR kỹ thuật số của hãng Bio-Rad, hay còn gọi là PCR vi giọt kỹ thuật số (Droplet DigitalTM PCR, ddPCRTM). Quy trình này tương đối đơn giản. Đầu tiên, hệ thống máy tạo giọt QX200 Droplet Generator sẽ phân chia phản ứng PCR (có DNA bên trong) thành hàng ngàn vi giọt có kích thước nanolit. Sau khi quá trình PCR xảy ra, từng vi giọt của từng phản ứng ban đầu sẽ được phân tích trên hệ thống đọc vi giọt QX200 Droplet Reader để đếm số giọt âm và dương tính. Dựa vào kết quả đếm này, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân bố Poisson để xác định số lượng bản sao DNA mục tiêu có trong phản ứng ban đầu (trước khi phân chia thành vi giọt). Sau đây là các bước chi tiết của quy trình PCR kỹ thuật số.

Chuẩn bị phản ứng PCR với mẫu

Việc chuẩn bị phản ứng ddPCR tương tự như phản ứng PCR thông thường nhưng sử dụng một loại supermix dành riêng cho quy trình PCR kỹ thuật số. Phản ứng cũng bao gồm các thành phần cơ bản như enzyme Taq polymerase, mồi, dNTP, ma-giê, v.v… và bổ sung thêm chất phát quang EvaGreen hoặc mẫu dò huỳnh quang TaqMan. Các mẫu DNA sẽ được bổ sung vào các phản ứng này. Tổng thể tích cuối cùng của phản ứng là 20 μL. Cũng giống như khi chạy PCR, bên cạnh các phản ứng cho mẫu xét nghiệm, kỹ thuật viên thường chạy thêm các phản ứng chứng dương (chứa DNA mục

Tạo vi giọt cho PCR kỹ thuật số

Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là máy tạo vi giọt QX200 Droplet Generator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có kích thước và thể tích đồng đều (khoảng 1 nL) trong hệ thống vi kênh (microfluidics). Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng PCR như trên và trở thành 1 phản ứng tí hon. Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này. Bước tạo giọt này cần khoảng 30 phút cho 96 phản ứng PCR.

Phản ứng PCR xảy ra trong các vi giọt

Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy PCR. Khi chương trình luân nhiệt diễn ra, DNA mục tiêu có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu ban đầu được phân bố vào vi giọt. Bước PCR này mất khoảng 2 giờ đồng hồ.

Đọc tín hiệu trong vi giọt

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang của hãng Bio-Rad gọi là QX200 Droplet Reader. Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer. Từng vi giọt trong mỗi giếng trên đĩa PCR sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang. Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại. Hiện tại, máy đọc vi giọt của Bio-Rad đọc được 3 loại màu huỳnh quang khác nhau là FAM, VIC và HEX, cho phép người dùng phát hiện cùng lúc nhiều trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng một vi giọt. Để đọc vi giọt từ 96 giếng PCR, máy đọc vi giọt cần khoảng 3 giờ đồng hồ.

Phân tích dữ liệu của quy trình PCR kỹ thuật số

Phân tích dữ liệu: Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm phân tích trên máy vi tính. Đối với từng phản ứng 20 μL ban đầu, kết quả được phân tích bao gồm:

• Tổng số vi giọt (droplet) tạo ra được từ 20 μL phản ứng ban đầu, bao gồm vi giọt dương tính và vi giọt âm tính.

• Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so với ngưỡng).

• Tổng số vi giọt âm tính (không chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang thấp hơn ngưỡng

Kết quả của quy trình PCR kỹ thuật số khi phát hiện đồng thời 2 trình tự mục tiêu khác nhau có thể được quan sát dưới dạng đồ thị 2 chiều (2-D plot). Trục tung sẽ là cường độ màu FAM và trục hoành sẽ là cường độ màu HEX. Vì các loại trình tự DNA khác nhau được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt nên kết quả có thể bao gồm 4 nhóm vi giọt sau:

• Vi giọt âm tính với màu FAM, âm tính với màu HEX

• Vi giọt dương tính với màu FAM, âm tính với màu HEX

• Vi giọt âm tính với màu FAM, dương tính với màu HEX

• Vi giọt dương tính với màu FAM, dương tính với màu HEX

Dựa vào số lượng vi giọt dương tính và tổng số vi giọt tạo ra từ mỗi phản ứng ban đầu, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính ra nồng độ DNA mục tiêu có trong 20 μL thể tích phản ứng ban đầu.