Chỉnh sửa gen đang biến đổi mạnh mẽ ngành công nghệ sinh học, thúc đẩy các lãnh vực phát hiện thuốc, sinh tổng hợp và phát triển các chiến lược điều trị mới nhờ khả năng thay đổi trình tự DNA một cách chính xác ngay trong tế bào và sinh vật sống. Các công nghệ chỉnh gen có bề dày cũng như mới hình thành đều giúp cải thiện nhiều kết quả điều trị như mong muốn, gồm sửa sai các biến đổi di truyền gây bệnh, điều tra chức năng gen hay thiết lập các liệu pháp cá nhân hoá. Trái ngược với nhóm công nghệ chỉnh gen đa dạng trên thị trường, những phương pháp để xác định hiệu suất chỉnh sửa vẫn đang là vấn đề nan giải về thời gian và nguồn lực. Mẫu phải được sàng lọc kết quả lệch đích, tức chỉnh sửa xảy ra ở những vị trí ngoài dự kiến. Quá trình sửa sai DNA tại các vị trí trúng và lệch mục tiêu có thể gây ra các đột biến chèn hoặc mất, cũng như những biến dị cấu trúc (lặp đoạn, đảo đoạn, mất đoạn lớn hay chuyển đoạn) ảnh hưởng đến biểu hiện gen hoặc gây hại di truyền (genotoxicity). Được phát triển để định lượng tuyệt đối trực tiếp nucleic acid, ddPCR là một phương pháp siêu nhạy, cho phép phát hiện các kết quả chỉnh gen có hàm lượng thấp cũng như tối ưu quá trình kiểm soát chất lượng, từ đó giải quyết những khó khăn chính trong quy trình chỉnh sửa gen.

CÁC CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN

Phép chỉnh sửa gen hiện tại sử dụng công cụ là các nuclease cải biến để nhắm cắt chính xác trình tự DNA và khai thác các lộ trình sửa sai DNA của tế bào để đạt được chỉnh sửa mong muốn. Các công cụ đời trước như zinc finger nuclease (ZFN) và transcription activator-like effector nuclease (TALEN) là những enzyme cải biến, gồm một cấu phần (domain) DNA endonuclease không đặc hiệu dung hợp với một cấu phần gắn đặc hiệu với trình tự DNA nhằm tạo ra các điểm gãy mạch đôi (DSB) trúng đích. Khi DNA bị cắt gãy, tế bào sửa chữa thông qua phép nối đầu không tương đồng (NHEJ), thường tạo ra lỗi và có thể phá huỷ cấu trúc gen, hoặc sửa chữa theo tính tương đồng (HDR) dựa trên một trình tự tương đồng (homologous sequence) sẵn có làm khuôn, có thể tạo ra các tình trạng chèn điểm/đoạn, mất điểm/đoạn hoặc đột biến khác. Tuy nhiên, ZFN và TALEN có những hạn chế nổi bật, đơn cử như việc thiết kế và tổng hợp ra các protein dung hợp dạng này thường phức tạp và tiêu tốn nhiều công sức. Sự phát triển của hệ CRISPR-Cas9 sử dụng RNA dẫn đường (guide RNA) để đưa enzyme Cas9 tới đúng vị trí đặc hiệu đã tạo ra làn sóng ứng dụng và tinh chỉnh phương tiện này thành một công nghệ chỉnh sửa gen. Bên cạnh khả năng gây ra DSB và tận dụng được các cơ chế sửa sai DNA giống như ZFN và TALEN, hệ này còn sở hữu nhiều ưu điểm, như dễ dàng điều hướng đến một hay nhiều trình tự đích bất kỳ thông qua phương pháp kết hợp đa đích (multiplexing). Nhiều công cụ tiên tiến hơn phái sinh từ CRISPR-Cas9 hướng đến việc không tạo ra DSB. Các phân tử sửa base (base editor), gồm một Cas9 nickase (đã cải biến hoạt tính xúc tác) gắn với một deaminase (có hoạt tính biến đổi hoá học nucleotide này thành nucleotide khác), cho phép tạo ra chính xác các đột biến điểm. Công nghệ chỉnh sửa mồi dẫn (prime editing) đã đẩy khả năng chỉnh gen đi xa hơn nữa bằng cách dung hợp một Cas9 nickase với một reverse transcriptase (RT), sử dụng RNA dẫn đường dung hợp với mạch khuôn RT và một đoạn trình tự bám mồi (primer-binding site, PBS). Mạch DNA bổ sung sẽ bị cắt gãy (nick, gãy mạch đơn) và được RT kéo dài ra ngay khi enzyme này bắt vào PBS; trình tự mạch khuôn RT được đưa vào vị trí đích. Hướng đi này cho phép chèn, xoá hoặc thay thế các đoạn trình tự DNA ngắn. Các phân tử sửa bằng mồi (prime editors) liên tục được cải tiến khi Cas9 tiếp tục được chỉnh sửa và các protein ổn định mạch khuôn RNA được thêm vào để giảm tối thiểu tỷ lệ lỗi có thể xảy ra.

ỨNG DỤNG CHỈNH SỬA GEN

Chỉnh sửa gen mang trong mình tiềm năng kích hoạt các bước tiến mạnh mẽ, lớn lao trong y học. Với khả năng chỉnh sửa chính xác các yếu tố di truyền bệnh sinh, nhóm công nghệ này có thể được ứng dụng rộng rãi để phát triển các liệu pháp mới cho nhiều loại bệnh tật, gồm các bệnh lý rối loạn bẩm sinh, ung thư và bệnh truyền nhiễm. Quan trọng là chỉnh sửa gen tạo nên bệ phóng để phát triển các phép điều trị được thiết lập riêng cho từng bệnh nhân và được thiết kế cho những bệnh lý hiếm gặp. Ngay trong năm 2026, một hệ thống chỉnh sửa gen cá nhân hoá bằng CRISPR đã được áp dụng thành công trên một bệnh nhân để điều trị thiếu hụt carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) – bệnh lý di truyền hiếm gặp và nguy hiểm tới tính mạng. Thiếu hụt CPS1 làm cản trở quá trình xử lý phụ phẩm từ chuỗi chuyển hoá protein trong gan, gây triệu chứng tích tụ ammonia có hại thường thấy ở bệnh nhân trong giai đoạn sơ sinh. Bệnh nhân thử nghiệm được nhận hai liều điều trị vào khoảng tháng tuổi thứ 7 và 8; sau đó, lượng protein trong khẩu phần có thể tăng lên, song song với việc giảm điều trị kiểm soát lượng ammonia. Không có tác dụng phụ nghiêm trọng nào xảy ra, cho thấy hệ thống này có thể được điều chỉnh để điều trị các hội chứng di truyền khác, mặc dù tính an toàn và hiệu lực về lâu dài vẫn cần được đánh giá thêm. Bên cạnh đó, thử nghiệm lâm sàng pha 1 lần đầu trên người cho một liệu pháp chỉnh gen CRISPR-Cas9 khác cũng vừa hoàn tất trên các bệnh nhân mắc ung thư biểu mô dạ dày-ruột di căn tiến triển. Thông qua truy đích và bất hoạt gen CISH mã hoá một protein checkpoint miễn dịch nội bào ở bạch cầu bạch huyết (lymphocyte) xâm nhập khối u (tumor-infiltrating lymphocyte, TIL), liệu pháp này có thể kích thích hoạt tính kháng khối u. Trong nghiên cứu, 12 người bệnh được nhận một liều tiêm TIL tự thân đã qua chỉnh sửa. Tình trạng bệnh giữ ổn định đối với sáu (50%) và bốn (33%) bệnh nhân lần lượt ở 28 và 56 ngày. Đáng chú ý là một bệnh nhân kháng các liệu pháp miễn dịch khác đã xuất hiện đáp ứng hoàn toàn, kéo dài hơn 21 tháng.  Kết quả trên cho thấy việc chỉnh sửa một gen mới trong TIL bằng CRISPR-Cas9 có thể đem tới nhiều lựa chọn điều trị trong tương lai cho bệnh nhân mắc ung thư di căn tiến triển kháng các chất ức chế checkpoint miễn dịch hiện hành.

KHÓ KHĂN TRONG ĐO LƯỜNG HIỆU SUẤT CHỈNH SỬA

Trong bối cảnh chỉnh sửa gen đang không ngừng mở rộng các khả năng điều trị, hiệu suất của chúng lại bị giới hạn bởi nhiều yếu tố, trong đó có loại tế bào, mà cụ thể là tế bào sơ cấp (primary cell) hay tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC). Hiệu suất chỉnh sửa ở các loại tế bào này có thể rơi xuống dưới 5%, đòi hỏi các kỹ thuật siêu nhạy để đo lường chính xác kết quả điều chỉnh gen. Các phương pháp thông dụng như giải trình tự Sanger hay các phép kiểm tra bằng gel thường không hiệu quả trong việc nhận diện đối tượng chỉnh sửa thành công tồn tại ở nồng độ thấp trong các quần thể tế bào dị tạp (heterogeneous) về mặt di truyền. Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) có thể là một lựa chọn thay thế nhạy hơn, song, vẫn tồn tại những chướng ngại lớn liên quan tới quy trình phức tạp và chi phí. Hơn nữa, việc chuẩn bị mẫu cho NGS có thể vô tình tạo ra các sai số ảnh hưởng đến việc phát hiện allele đã chỉnh sửa, làm lệch kết quả cuối cùng. Khắc phục các hạn chế kể trên là cần thiết để tối ưu hoá quy trình chỉnh sửa gen và thúc đẩy các ứng dụng trị liệu.

CÔNG NGHỆ ddPCR VÀ CÁCH PHỐI HỢP VÀO CHỈNH SỬA GEN

ddPCR là một phương pháp nhanh, siêu nhạy để định lượng tuyệt đối trực tiếp nucleic acid. Độ nhạy và độ chính xác mà ddPCR có được là nhờ vào nguyên tắc phân đoạn (partitioning) mẫu thành ~20.000 vi giọt cỡ nano-lít, mỗi vi giọt là một phản ứng PCR độc lập. Từ cỡ mẫu lớn đó, phép thống kê Poisson được dùng để định lượng tuyệt đối nucleic acid mà không cần tới đường chuẩn. Ngoài ra, quy trình ddPCR đơn giản, tiết kiệm và có nhiều lựa chọn về công suất xử lý mẫu. Kết hợp ddPCR vào quy trình chỉnh sửa gen sẽ giúp đánh giá kết quả và hiệu suất chỉnh sửa trình tự đích một cách chính xác và tiện lợi. Ví dụ, ddPCR đã được dùng làm công cụ sàng lọc các dòng tế bào chèn gen (knock-in) bằng CRISPR-Cas9, báo hiệu cho tế bào thần kinh sinh tiết dopamine (dopaminergic neuron) phát xuất từ iPSC người. Các dòng này được điều chỉnh để biểu hiện protein huỳnh quang lục tăng cường (eGFP), kiểm soát bằng promoter nội sinh của tyrosine hydroxylase – một chỉ dấu phổ biến cho loại tế bào thần kinh trên. Xét nghiệm ddPCR được thiết kế để phát hiện đồng thời hiện tượng chèn eGFP và nhận diện các đối tượng HDR thành công bằng cách bắt lên vùng di truyền nằm về phía đầu nguồn của trình tự tương đồng (trình tự này được tạo dòng và dung hợp với eGFP). Bởi đó mà nhân bản chỉ xảy ra khi có sự tái tổ hợp tại đúng locus gen đã định. Ngoài ra, ddPCR có thể dùng để nghiên cứu chức năng gen và đánh giá đột biến chèn, mất hoặc biến dị cấu trúc theo thời gian, chẳng hạn như ở các tế bào sau điều chỉnh đang trong quá trình tăng sinh dòng (clonal expansion). Phương pháp này có thể dùng để đánh giá tiềm năng chuyển hoá sinh ung (oncogenic transformation) của các tế bào qua chỉnh sửa. Song song đó, nhờ cơ chế phân đoạn mẫu thành hàng ngàn phản ứng độc lập, ddPCR có khả năng chịu đựng tác động từ các yếu tố ức chế PCR tốt hơn so với real-time PCR, đem lại ưu thế khi phân tích các mẫu lâm sàng phức tạp trong nhiều ứng dụng như nghiên cứu ung thư và theo dõi tải lượng virus.

KẾT LUẬN

Việc tích hợp ddPCR vào quy trình chỉnh sửa gen sẽ đẩy nhanh quá trình cải tiến trong công nghệ sinh học và y học nhờ khả năng khắc phục những khó khăn cốt lõi trong phân tích chỉnh sửa di truyền, đặc biệt là trong các loại tế bào sơ cấp và các nền mẫu phức tạp khác. Là một phương pháp siêu nhạy, chính xác và tiện dụng để định lượng tuyệt đối trực tiếp nucleic acid, ddPCR cho phép phát hiện kết quả điều chỉnh gen có tần suất thấp, cũng như đánh giá hiệu suất mà vẫn giữ được hai yếu tố quan trọng đối với chỉnh sửa gen: nhanh và tiết kiệm.