Một phản ứng Real-time PCR bao gồm những thành phần cơ bản nào?

Trước khi tìm hiểu về những cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR, chúng ta cần điểm lại các thành phần cơ bản của một phản ứng Real-time PCR.

1. Dung dịch đệm: bao gồm các loại muối như Tris-HCl, KCl
2. Ion Ma-giê (Mg2+): giúp ổn định phức hợp enzyme Taq polymerase, mồi và mạch khuôn
3. Enzyme Taq polymerase: tổng hợp mạch mới
4. Nucleotide tự do dạng triphosphate (dNTP): nguyên liệu để tổng hợp mạch mới
5. Mồi: bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, giúp nhân bản đúng gen mục tiêu
6. Mẫu dò huỳnh quang: có nhiều dạng khác nhau, bám trên DNA mạch khuôn, giúp phát hiện và theo dõi số lượng sản phẩm nhân bản. Trong trường hợp không sử dụng mẫu dò thì chúng ta có thể bổ sung chất phát quang như SYBR Green hay EvaGreen vào trong phản ứng.
7. Nước (không chứa các enzyme nuclease): môi trường cho phản ứng diễn ra
8. DNA, cDNA hoặc RNA mạch khuôn

Cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR với các thành phần đơn lẻ

Cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR đầu tiên chính là bổ sung lần lượt 8 thành phần trên vào ống chứa phản ứng. Các thành phần chính như Taq polymerase, dung dịch đệm và ma-giê (dưới dạng MgCl2) thường được cung cấp trong một bộ sản phẩm như trong Hình 1. Ngoài bộ sản phẩm này ra, người sử dụng cần mua riêng các thành phần còn thiếu như dNTP, nước sinh học phân tử, mồi và mẫu dò (hoặc SYBR Green, EvaGreen).

Hình 1. Bộ sản phẩm iTaq DNA Polymerase (Nguồn: Bio-Rad)

Sau khi có đầy đủ các thành phần cơ bản, bạn cần tham khảo công thức pha chế phản ứng Real-time PCR khuyến cáo cho bộ sản phẩm Taq polymerase mà bạn đã mua. Trong công thức này, bạn nên chú ý đến nồng độ cuối cùng ma-giê,Taq polymerase, mồi và mẫu dò. Với lần chạy đầu tiên, tôi khuyên bạn nên sử dụng công thức khuyến cáo này. Sau đó, bạn có thể tiến hành thay đổi nồng độ của các thành phần này để phản ứng hoạt động tốt hơn.

Hình 2. Công thức pha chế phản ứng Real-time PCR với thành phần đơn lẻ (Nguồn: Bio-rad)

Cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR từ các thành phần đơn lẻ này có một vài ưu điểm như sau:

1. Dễ dàng thay đổi nồng độ của các thành phần để phản ứng hoạt động tốt hơn. Đây gọi là quá trình tối ưu hóa phản ứng Real-time PCR.
2. Enzyme Taq polymerase được bảo quản trong dung dịch glycerol có độ bền cao hơn do không bị đông và rã đông nhiều lần.
3. Tạo ra công thức phản ứng Real-time PCR cho riêng bạn như một “bí mật công nghệ”. Điều này rất quan trọng với các công ty sản xuất các bộ kit sử dụng kỹ thuật Real-time PCR.
4. Có thể giảm hàm lượng enzyme nhằm tiết kiệm chi phí.

Cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR với supermix

Việc pha chế phản ứng Real-time PCR từ các thành phần đơn lẻ như trên tuy có nhiều ưu điểm nhưng sẽ gây mất thời gian và tạo nên nhiều sai số (do có nhiều bước thao tác hút, nhả pipette). Hai nhược điểm này sẽ có ảnh hưởng rõ rệt hơn nếu bạn làm trong một phòng thí nghiệm cung cấp dịch vụ chẩn đoán bằng Real-time PCR. Vậy bạn nên làm thế nào?

Cách chuẩn bị phản ứng Real-time PCR thứ hai là sử dụng các supermix thương mại. Supermix là hỗn hợp chứa phần lớn các thành phần chính của phản ứng như Taq polymerase, MgCl2, dNTP, dung dịch đệm, SYBR Green / EvaGreen (nếu bạn không dùng mẫu dò huỳnh quang) ở dạng đậm đặc (thường là 2X). Đặc biệt, các supermix cao cấp thường được nhà sản xuất bổ sung thêm chất ổn định cấu trúc enzyme (stabilizer) nhằm đảm bảo enzyme Taq polymerase vẫn hoạt động tốt sau nhiều lần đông và rã đông. Ngoài ra, cũng nhằm mục đích tạo ra “bí mật công nghệ”, các nhà sản xuất supermix còn bổ sung thêm “phụ gia bí mật” để tăng cường hoạt động của enzyme gọi là “enhancer” (Hình 3). Enhancer sẽ là trợ thủ đắc lực cho enzyme khi phải nhân bản những vùng gen khó (giàu GC) hoặc khi mẫu DNA có chứa chất ức chế.

Hình 3. Thành phần của một supermix thương mại SsoAdvanced Universal Probe Supermix (Nguồn: Bio-rad)

Khi sử dụng supermix, bạn sẽ thấy việc pha chế phản ứng Real-time PCR trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Chỉ với 3-4 thao tác hút và nhả pipette, bạn sẽ có ngay một phản ứng hoàn chỉnh (Hình 4). Sự tiện lợi này sẽ càng trở nên quan trọng đối với những phòng thí nghiệm có ít kinh nghiệm về Real-time PCR.

Hình 4. Công thức pha chế phản ứng Real-time PCR sử dụng supermix thương mại (Nguồn: Bio-rad)

Một vài ưu điểm nổi bật khi dùng supermix như sau:

1. Tiết kiệm thời gian pha chế phản ứng
2. Giảm thiểu thao tác pipette nên giảm sai số trong quá trình pha chế, tăng độ tái lặp của quy trình
3. Đảm bảo phản ứng Real-time PCR hoạt động tốt, ngay cả với những kỹ thuật viên chưa có kinh nghiệm
4. Phản ứng có thể đạt hiệu suất cao hơn so với khi dùng các thành phần đơn lẻ

Đối với những phòng thí nghiệm dịch vụ, thời gian và độ tái lặp của quy trình là cực kỳ quan trọng. Chính vì vậy, đại đa số các bệnh viện, trung tâm dịch vụ ở Việt Nam hiện tại đang dùng supermix thay vì các thành phần phản ứng đơn lẻ như trước đây.