Liệu pháp tế bào T đính thụ thể dung hợp bắt kháng nguyên (Chimeric antigen receptor/CAR T-cell) đã cứu vãn nhiều bệnh nhân ung thư, cho họ thêm nhiều năm sống sót khi mà những phương pháp điều trị khác đã bế tắc. Tuy nhiên, khi các sản phẩm này được phát triển tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng, mỗi liệu trình — thậm chí mỗi mẻ thuốc trong cùng một liệu trình — có thể tồn tại những khác biệt đáng kể. Các nhà phát triển có thể sản xuất các liệu trình CAR T-cell bằng nhiều cách. Bên cạnh đó, dù mỗi mẻ thuốc được tạo ra từ cùng một nguồn tế bào T của bệnh nhân, những tế bào này có thể phát triển và hoạt động khác nhau vì chịu những yếu tố tác động trước đó khác nhau.

Vậy nên, việc kiểm soát và đánh giá chất lượng là đặc biệt cần thiết trong quá trình sản xuất CAR T-cell. Nhà phát triển có thể sử dụng các phương pháp phân tử để kiểm tra hiệu lực, khả năng bảo lưu và tình trạng tạp nhiễm của mẻ CAR T-cell. Công việc này làm tăng tối đa khả năng tác động của liệu trình để giúp đỡ bệnh nhân, đồng thời giảm tối thiểu nguy cơ gây hại. Những lợi ích trên sẽ giúp nâng cao khả năng thành công của liệu trình trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng. Để có được điều đó, các nhà khoa học cần những công cụ tinh nhạy và chính xác cho việc theo dõi sản xuất lâm sàng CAR T-cell, đảm bảo quy trình sẽ cho ra sản phẩm an toàn và hiệu quả khi tiêm truyền cho từng bệnh nhân.

Sử dụng đúng công nghệ để thu đúng liều CAR T-Cell

Tuỳ theo cơ sở vật chất, tình trạng tế bào và các yếu tố khó dự đoán khác, các mẻ tế bào T khác nhau sẽ thu nhận số lượng bản sao gen chuyển CAR khác nhau sau quá trình chuyển nạp (transfection). Những CAR T-cell chứa quá nhiều bản sao gen chuyển CAR có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch nguy hiểm trong cơ thể bệnh nhân, còn những CAR T-cell không tiếp nhận được bất kỳ bản sao gen nào sẽ không tấn công các tế bào ung thư một cách hiệu quả (Brudno và Kochenderfer 2016). FDA tuyên bố các CAR T-cell nên chứa một đến bốn bản sao gen chuyển — “một khoảng hẹp” (Zhao và cs. 2017). Vì vậy, nhà phát triển cần một phương pháp chính xác cao để xác định số lượng bản sao gen chuyển CAR trong tế bào, tránh cung cấp cho bệnh nhân những tế bào có quá nhiều hoặc quá ít bản sao gen.

Đến gần đây, PCR định lượng (qPCR) trở thành phương pháp thiết yếu để xác định số bản sao gen chuyển trong mảng kiểm soát chất lượng CAR T-cell và nhiều lĩnh vực khác. Tuy nhiên, vì phải phụ thuộc vào đường chuẩn nên phương pháp này rất dễ bị lỗi người thao tác và các biến động khác tác động, đồng thời không đủ nhạy để phát hiện trường hợp một bản sao gen trong mỗi tế bào. qPCR không đủ chính xác hoặc độ lặp lại để giúp các nhà nghiên cứu xác nhận liệu các CAR T-cell có chứa số lượng bản sao gen chuyển CAR đủ an toàn và hiệu quả hay không. Trái ngược với qPCR, công nghệ Droplet Digital™ PCR (ddPCR™) đem lại khả năng định lượng nucleic acid trực tiếp, rất phù hợp để xác định số bản sao gen chuyển một cách chính xác (Lu và cs. 2020).

Các nhà khoa học đã chứng minh độ nhạy vượt trội của ddPCR bằng nhiều thử nghiệm nghiêm ngặt. TS. Yaoyao Lou và cộng sự tại Đại học Khoa học và Công nghệ Hoa Trung tại Vũ Hán, Trung Quốc đã so sánh các xét nghiệm qPCR và ddPCR trong kiểm soát chất lượng CAR T-cell (Lou và cs. 2020). Nhóm phát hiện các xét nghiệm ddPCR nhạy hơn các xét nghiệm qPCR khi đo mẫu DNA CAR chuẩn được pha loãng, có thể phát hiện tới 3,2 bản sao gen chuyển trong một mililit, trong khi qPCR không thể đạt được khả năng này.

CAR T-Cell có thể bảo lưu trong cơ thể người bệnh bao lâu?

Xa hơn việc xác định số lượng bản sao gen chuyển, các nhà nghiên cứu và bác sĩ lâm sàng cần phải xác định và tối ưu hoá khả năng bảo lưu CAR T-cell — thời lượng mà các tế bào chỉnh sửa này sống và tuần hoàn trong cơ thể người bệnh. Về lý thuyết, các tế bào phải sống được trong vài tháng sau điều trị để đảm bảo tiệt trừ tận gốc ung thư. Tuy nhiên, những CAR T-cell đi quá giới hạn này có thể gây tác dụng phụ về miễn dịch hay thần kinh (Lou và cs. 2020).

Các nhà nghiên cứu và chuyên gia y tế có thể theo dõi khả năng bảo lưu CAR T-cell một cách xuyên suốt nhờ một chuỗi xét nghiệm ddPCR cho phép phát hiện và định lượng CAR T-cell trong mẫu máu (Mika và cs. 2020). Luo và cộng sự nhận thấy qPCR chỉ đủ nhạy để phát hiện thấp nhất là 20 bản sao CAR trong một phản ứng chạy mẫu máu, trong khi ddPCR có thể phát hiện thấp nhất là 5 bản sao CAR trong một phản ứng. Các xét nghiệm ddPCR cũng thể hiện độ lặp lại vượt trội (Lou và cs. 2020).

Phát hiện virus khả nạp khả sao (replication-competent virus) và các tạp nhiễm khác

Một trong số thách thức xuất hiện khi phát triển liệu pháp CAR T-cell là phòng chống tạp nhiễm trong sản phẩm. Các vector virus chuyển nạp gen CAR vào tế bào T, về lý thuyết, có thể sao mã và tồn tại bên trong bệnh nhân. Điều này xảy ra có thể gây nhiều hệ luỵ nghiêm trọng cho sức khoẻ. Do đó, FDA tuyên bố các nhà khoa học cần kiểm nghiệm virus khả nạp khả sao trong suốt quá trình sản xuất lâm sàng CAR T cell và ở bệnh nhân sau tiêm truyền (U.S. FDA 2001).

Nhờ độ tinh nhạy rất cao, công nghệ ddPCR được chứng minh là một phương pháp lý tưởng để phát hiện những dấu hiệu nhỏ nhất của virus khả nạp khả sao, cho phép nhà sản xuất sàng lọc bất kỳ mẻ thuốc nào có chứa virus trước khi truyền tế bào vào bệnh nhân (Wiltshire và cs. 2021). Cũng như các liệu pháp gen và tế bào khác, sản phẩm CAR T-cell dễ bị nhiễm các tác nhân tạp khác như vi khuẩn Mycoplasma. Xét nghiệm ddPCR là công cụ nhạy nhất để phát hiện những tác nhân này ở mỗi giai đoạn sản xuất.

Tương lai của liệu pháp CAR T-Cell

Liệu pháp CAR T-cell chắc chắn sẽ tiếp tục được cải tiến và trở nên đa dạng trong những năm tới. Các nhà nghiên cứu đang chặn đứng ngày càng nhiều loại ung thư khác nhau — kể cả khối u rắn — bằng nhiều loại CAR T-cell mới (Sterner và Sterner 2021). Hiển nhiên, các nhà phát triển sẽ cần đến những phương pháp kiểm soát chất lượng đủ sức bắt kịp với tiềm năng và độ phức tạp của liệu pháp này.

Hình ảnh 1: Hệ thống QX200™ Droplet Digital PCR đem lại độ chính xác và độ nhạy xuất sắc.

Công nghệ ddPCR đem lại độ nhạy, độ chính xác và độ linh hoạt cần có để đáp ứng những phát triển lớn lao này. Nếu có thể tận dụng công nghệ này song song hợp tác với các nhà quản lý để cải thiện tiêu chuẩn và phương pháp sản xuất CAR T-cell, giới dẫn đầu ngành công nghiệp y sinh có thể đưa nhiều liệu pháp điều trị quý giá vào lâm sàng để cứu sống bệnh nhân.

Truy cập website của Bio-Rad để biết rõ hơn về công nghệ Droplet Digital PCR và cách mà công nghệ này cải thiện việc kiểm soát chất lượng CAR T-cell.

Tài liệu tham khảo

• Brudno JN and Kochenderfer JN (2016). Toxicities of chimeric antigen receptor T cells: recognition and management. Blood 127, 3,321–3,330.
• Lou Y et al. (2020). Detection and Quantification of Chimeric Antigen Receptor Transgene Copy Number by Droplet Digital PCR versus Real-Time PCR. J Mol Diagn 22, 699–707.
• Lu A et al. (2020). Application of droplet digital PCR for the detection of vector copy number in clinical CAR/TCR T cell products. J Transl Med 18, 191.
• Mika T et al. (2020). Digital-Droplet PCR for Quantification of CD19-directed CAR T-cells. Front in Mol Biosci 7, 84.
• Sterner RC and Sterner RM (2021). CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J 11, 69.
• U.S. FDA (2001). Supplemental guidance on testing for replication-competent retrovirus in retroviral vector-based gene therapy products and during follow-up of patients in clinical trials using retroviral vectors. Hum Gene Ther 12, 315–320.
• Wiltshire T et al. (2021). Sensitive detection of integrated and free transcripts in chimeric antigen receptor T-cell manufactured cell products using droplet digital polymerase chain reaction. Cytotherapy 23, 452–458.
• Zhao Y et al. (2017). Development of the first World Health Organization lentiviral vector standard: Toward the production control and standardization of Lentivirus- Based Gene Therapy Products. Hum Gene Ther Methods 28, 205–214.

BIO-RAD, DDPCR, and DROPLET DIGITAL are trademarks of Bio-Rad Laboratories, Inc. All trademarks used herein are the property of their respective owner.

© 2022 Bio-Rad Laboratories, Inc.