Giới thiệu

Năm 2017, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) phê duyệt liệu trình CAR T-cell đầu tiên: tisagenlecleucel, để điều trị bệnh bạch cầu cấp nguyên bào dòng lympho (acute lymphoblastic leukemia, ALL), đánh dấu kỷ nguyên mới trong chữa trị ung thư (Mullard 2017). Sau tisagenlecleucel, có ít nhất năm liệu trình CAR T-cell nữa được phê duyệt, tất cả đều dùng cho ung thư máu (National Cancer Institute 2022). Không giống những phương án điều trị ‘tất cả như một’ như hoá trị hay xạ trị, liệu pháp CAR T-cell là phương án điều trị mang tính cá thể cao, trong đó tế bào T của chính bệnh nhân được tái cấu trúc để nhắm vào tế bào ung thư. Phương án mới mẻ này trang bị cho hệ miễn dịch của người bệnh công cụ sinh học cần thiết để tự tiêu diệt ung thư.

Sản xuất CAR T-cell là quy trình gồm nhiều bước (Abou-el- Enein và cs. 2021). Đầu tiên, tế bào T được phân lập từ bệnh nhân bằng kỹ thuật gạn tách bạch cầu, sau đó được chọn lọc và kích hoạt. Tiếp theo, tế bào T được chỉnh sửa gene để biểu hiện CAR, thông thường là bằng vector virus. Các tế bào T biểu hiện CAR cuối cùng được nhân lên, xác định rõ đặc điểm hoạt tính và lưu trữ (trữ đông) cho tới khi được truyền lại vào bệnh nhân.

Việc sản xuất và sử dụng liệu pháp CAR T-cell cần được theo dõi nghiêm ngặt để đảm bảo độ an toàn và hiệu quả tối đa. Hiện nay, mọi liệu trình CAR T-cell được phê duyệt cho lâm sàng đều sử dụng vector virus để chèn các gen CAR vào bộ gen của tế bào T, tuy nhiên phương pháp này có thể ẩn chứa rủi ro do tính ngẫu nhiên trong quy trình (Abou-el-Enein và cs. 2021). Nếu gen CAR chèn vào những vị trí kích hoạt hoặc bất hoạt chất ức chế khối u thì những tế bào đó có thể mang khả năng gây ung thư. Nếu gen CAR chèn vào những vị trí không mã hoá trong bộ gen thì gen CAR này có khả năng hoàn toàn không được biểu hiện. Có quá nhiều khả năng kết hợp gây nguy hiểm trong khi có quá ít khả năng không làm giảm hiệu quả (Brudno và Kochenderfer 2016). Vậy nên các nhà sản xuất cần theo dõi vị trí và số bản sao gen CAR được kết hợp vào để đảm bảo quá trình tải nạp virus cho ra những tế bào CAR-T an toàn và hiệu quả. Việc theo dõi độ an toàn và độ hiệu quả cũng cần được thực hiện hậu sản xuất. Theo dõi CAR T cell sau khi được truyền lại vào bệnh nhân có thể cung cấp thêm thông tin về quá trình cấy ghép, tiến triển, bảo lưu cùng hiệu quả và độ an toàn của liệu trình.

PCR định lượng (Quantitative PCR, qPCR) lâu nay là lựa chọn thường thấy để xác định lượng kết hợp gen CAR. Tuy nhiên, nếu không có đường chuẩn thì qPCR chỉ là phương pháp định lượng tương đối. Những ai lưu tâm đến việc định lượng trực tiếp với độ nhạy tốt hơn sẽ cần đến công nghệ ddPCR. Bài báo này sẽ nêu rõ ứng dụng của công nghê ddPCR vào việc kiểm soát chất lượng quá trình sản xuất CAR T-cell.

Công nghệ ddPCR

Công nghệ ddPCR sử dụng công nghệ tạo vi giọt nhũ tương nước-dầu để chia nhỏ phản ứng PCR nguyên ống thành hàng chục ngàn vi giọt cỡ nano-lít, mỗi vi giọt đóng vai trò như một phản ứng PCR riêng biệt. Sản phẩm khuếch đại được đọc theo quy tắc nhị phân (vì vậy được gọi là kỹ thuật số); một vi giọt có thể chứa hoặc không chứa phân tử khuôn để nhân bản. Vì tính ngẫu nhiên trong việc phân phối phân tử DNA vào từng vi giọt nên một vi giọt có thể không chứa phân tử khuôn nào hoặc chứa một hoặc nhiều phân tử khuôn — dữ liệu thu được do đó phù hợp và có thể phân tích theo hướng định lượng bằng thống kê Poisson mà không cần sử dụng đường chuẩn. Với khả năng phát hiện đến một phân tử mục tiêu trong một tế bào, công nghệ ddPCR cực kỳ phù hợp để định lượng vector, định lượng số bản sao gen (Lu và cs. 2020) và phát hiện các mục tiêu hiếm như CAR T cell trong cơ thể bệnh nhân sau tiêm truyền (Fehse và cs. 2019).

Định lượng số bản sao gen CAR

Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Y tế Quốc gia Mỹ (National Institute of Health, NIH) do Ping Jin đứng đầu là bộ phận sản xuất CAR T cell cho Trung tâm Lâm sàng thuộc NIH (NIH Clinical Center). Họ sử dụng công nghệ ddPCR để kiểm soát chất lượng quy trình. Năm 2020, nhóm đã phát triển một xét nghiệm ddPCR dùng để theo dõi và định lượng trình tự gen CAR trong các tế bào T đã tải nạp virus (Lu và cs. 2020).

Để chứng minh tính hữu dụng của công nghệ ddPCR trong quy trình sản xuất CAR T-cell, Lu và đồng nghiệp sản xuất các CAR T cell sử dụng các vector ү-retroviral mã hoá một CAR- hoặc một TCR- nhận diện protein gây ung thư HPV16 E7. Số lượng bản sao của gen chuyển được phân tích trong bảy ngày bằng hệ thống ddPCR QX200™ AutoDG™ ngay sau khi tế bào bắt đầu được nuôi cấy.

Ban đầu, nhóm xác định giới hạn phát hiện trên và dưới của kỹ thuật ddPCR bằng một dãy pha loãng nồng độ chứa vector VSV-G trống (empty vesicular stomatitis virus G). Kết quả phân tích cho ra một khoảng động học rộng với giới hạn trên đạt 1 x 106 phân tử/μl và giới hạn dưới đạt 0,13 phân tử/μl. Để xác nhận lại khoảng động học này, Lu và đồng nghiệp tiếp tục định lượng số trường hợp có kết hợp gen chuyển trong một dãy pha loãng chứa các tế bào T đã chỉnh sửa để biểu hiện một TCR nhận diện oncoprotein HPV16 E7. Kết quả cho thấy có sự liên hệ tuyến tính giữa hệ số pha loãng và số phân tử gen chuyển. Họ cũng tiến hành định lượng các mẫu pha loãng bậc hai chứa vector retroviral dùng để tạo ra các tế bào T trên và nhận thấy cứ mỗi lần pha loãng, số phân tử đo được lại giảm đi một nửa.

Thú vị hơn là khả năng lặp lại kết quả giữa các điều kiện lưu trữ và người thao tác khác nhau. Các CAR T cell được trữ đông – một cách lưu trữ phổ biến trong quy trình sản CAR T-cell, cho kết quả giống nhau tại thời điểm sau không, ba và sáu tuần trữ đông, cho thấy biến số này có tác động rất nhỏ đến khả năng định lượng phân tử của kỹ thuật ddPCR. Việc định lượng do ba kỹ thuật viên khác nhau thực hiện cũng cho cùng một kết quả, làm nổi bật độ ổn định và độ lặp lại của xét nghiệm.

Cuối cùng, Lu và đồng nghiệp đánh giá độ ổn định của xét nghiệm giữa các điều kiện sản xuất khác nhau, bao gồm điều kiện mức độ nhiễm (multiplicity of infection, MOI) và điều kiện ly tâm. Khi không ly tâm, số phân tử vector tăng theo MOI. Tuy nhiên, khi có ly tâm, MOI sẽ tác động ít hơn đến số phân tử vector. Những biến số này tác động đến hiệu suất tải nạp theo cùng một cách vì hiệu suất tải nạp tương quan cao độ với số phân tử vector

Mối liên hệ giữa số phân tử và đáp ứng lâm sàng

Các CAR T cell có thể phát triển và thay đổi hoạt tính khi ở bên trong người bệnh nhân sau khi tiêm truyền. Vì những mục tiêu này có thể chỉ ra hiệu quả và độ an toàn của liệu trình CAR T-cell nên cần được theo dõi thường xuyên. Fehse và cộng sự (2020) đã phát triển một xét nghiệm ddPCR để định lượng chính xác số tế bào T biểu hiện CAR ở những bệnh nhân tiếp nhận điều trị theo liệu trình CAR T-cell được phê duyệt: axicabtagene ciloleucel.

Xét nghiệm được phát triển bằng cách so sánh nhiều tổ hợp đoạn mồi/đoạn dò (primer/probe) và chọn ra tổ hợp hoạt động tốt nhất, cho thấy sự tương khớp cao giữa các mẫu DNA bộ gen của CAR T-cell pha loãng bậc hai. Trong thử nghiệm này, giới hạn phát hiện dưới được xác định là một phân tử gen chuyển. Xét nghiệm cũng cho độ lặp lại cao giữa các lần chạy và giữa các mẫu lặp trong cùng mẻ chạy đối với mẫu thu từ năm bệnh nhân khác nhau đang điều trị bằng CAR T-cell.

Fehse và cộng sự tiếp tục phân tích mối tương quan giữa số phân tử vector và số CAR T-cell trong bệnh nhân. Với lượng mẫu còn lại trong các túi tiêm truyền (infusion bag), họ nhận thấy số phân tử trung bình trên mỗi tế bào tải nạp rơi vào khoảng 1,812–4,536 phân tử, nằm trong khoảng an toàn <5 phân tử/tế bào do FDA Mỹ quy định (Zhao và cs. 2017). Họ sử dụng giá trị này để đánh giá quá trình thay đổi của số CAR T-cell theo thời gian. Đúng như dự tính, bệnh nhân có CAR T cell phát triển in vivo cho đáp ứng lâm sàng hoàn toàn hoặc một phần vào khoảng 30 ngày sau điều trị. Ngược lại, những người không đáp ứng có lượng CAR T-cell phát triển ít. Tổng kết lại, những dữ liệu trên cho thấy công nghệ ddPCR có độ ổn định và độ nhạy cao khi ứng dụng vào việc phát hiện và theo dõi CAR T-cell in vivo.

Kết luận

Được phê duyệt lần đầu vào năm 2017, các liệu trình CAR T-cell vẫn là những ứng viên tương đối mới trong mảng điều trị ung thư. Khi liệu pháp CAR T-cell ngày càng hoàn thiện, những phương pháp sản xuất và ứng dụng cũng phải hoàn thiện theo. Phương pháp có thể định lượng chính xác, có độ lặp lại số bản sao gen CAR cũng như phát hiện CAR T cell in vivo sẽ đảm bảo liệu trình được sử dụng một cách an toàn và hiệu quả nhất có thể. Những ví dụ trình bày trên đây đã nêu bật đặc điểm ưu việt của công nghệ ddPCR trong theo dõi độ an toàn và hiệu quả của liệu pháp CAR T-cell xuyên suốt từ quá trình sản xuất đến ứng dụng vào lâm sàng.

Tài liệu tham khảo

• Abou-el-Enein M et al. (2021). Scalable Manufacturing of CAR T cells for Cancer Immunotherapy. Blood Cancer Discov 2, 408–422.
• Brudno JN and Kochenderfer JN (2016). Toxicities of chimeric antigen receptor T cells: recognition and management. Blood 127, 3,321–3,330.
• Fehse B et al. (2020). Digital PCR assays for precise quantification of CD19-CAR-T cells after treatment with axicabtagene ciloleucel. Mol Ther Methods Clin Dev 16, 172–178.
• Lu A et al. (2020). Application of Droplet Digital PCR for the detection of vector copy number in clinical CAR/TCR T cell products. J Transl Med 18, 191.
• Mullard A (2017). FDA approves first CAR T therapy. Nat Rev Drug Discov 16, 669.
• National Cancer Institute (2022). CAR T Cells: Engineering Patients’ Immune Cells to Treat Their Cancers. https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-t- cells, accessed August 11, 2022.
• Zhao Y et al. (2017). Development of the first World Health Organization lentiviral vector standard: Toward the production, control and standardization of lentivirus- based gene therapy products. Hum Gene Ther Meth 28, 205–214