Các liệu pháp điểu trị đích trong nhiều bệnh ung thư đã cho phép tiến bộ chưa từng có trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, việc thực hiện thường quy xét nghiệm bộ gen bị hạn chế do: 1) lượng mẫu đầu vào hạn chế (phạm vi pg – ng), 2) thách thức trong việc phát hiện tải lượng đột biến dưới 5%, 3) đánh giá chẩn đoán và thời gian quay vòng, và 4) chi phí. Do đó, để tối ưu hóa các chiến lược trị liệu cho cá nhân, điều quan trọng là phải nhanh chóng sàng lọc các mẫu bệnh nhân để tìm sự hiện diện của của nhiều đột biến KRAS. Chúng tôi đã phát triển Bộ kit sàng lọc
đa mục tiêu để sàng lọc các đột biến KRAS bằng cách sử dụng PCR kỹ thuật số vi giọt (ddPCR). Khả năng sàng lọc nhiều đột biến KRAS với tỉ lệ nhỏ xuống tới 0,2% trong một giếng giúp giảm khả năng các đột biến sẽ bị bỏ sót trong các mẫu DNA ngoại bào chất lượng kém và mẫu cố định bằng formalin, paraffin (FFPE) với lượng DNA có khả năng khuếch đại hạn chế.

Nguyên liệu và phương pháp

12 mẫu huyết tương bệnh nhân CRC đột biến (mCRC; 6 nữ, 6 nam, tuổi trung bình 52 tuổi) và 12 mẫu huyết tương bình thường (12 nữ) đã được mua từ Conversant Bio và Promeddx LLC. Năm mẫu mô mCRC được phân loại là chứng dương đột biến KRAS của nhà cung cấp, nhưng không được xét nghiệm như huyết tương. Các mẫu bổ sung được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Janku tại Trung tâm Ung thư MD Anderson. Các mẫu đã được chuẩn bị bằng quy trình tiêu chuẩn và bộ kit Qiaamp Ciculating Nucleic Acid Kit (Qiagen) Hệ thống PCR kỹ thuật số vi giọt Droplet Digital PCR (QX200) đã được thực hiện trên mẫu với thể tích 1-8,75 μL mỗi giếng sử dụng ddPCR KRAS Screening Multiplex Kit (Bio-Rad, danh mục #1863506) hoặc thử nghiệm đột biến ddPCR PrimePCR (PrimePCR ddPCR Mutation Assays) đã được xác thực cho 1 trong 7 đột biến KRAS (G12D, G12V, G13D, G12A, G12C, G12R, G12S,Bio-Rad) Các tham chiếu đối chứng dương từ Horizon Diagnostics và các đối chứng âm là loại hoang dại (wild type) - chỉ từ Promega Corporation (DNA bộ gen nữ [gDNA]). Ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng khoảng tin cậy 95%

Các kết quả

Hình 1. Phát hiện đa mục tiêu trong giếng đơn 7 đột biến KRAS .

A,Biểu đồ phân tán 2-D của hỗn hợp gDNA KRAS

B,dữ liệu chuỗi độ pha loãng sử dụng template gDNA G12D và hai giếng.

Hình 2. Các mẫu huyết tương không có tế bào mang lại lượng DNA cóthể khuếch đại rất khác nhau.

A,Biểu đồ 2-D plot của các xét nghiệm duplex (MYC, RPP30) được sử dụng để định lượng lượng DNA có thể khuếch đại.

B, 12 mẫu bình thường và 12 mẫu huyết tương CRC (52 lần lấy mẫu ) đã được định lượng và ba nhóm có sự thống kê khác biệt đáng kể (thử nghiệm Mann-Whitney). Các thanh sai số cho thấy độ lệch chuẩn trung bình cho bệnh nhân có nhiều lần lấy mẫu. Đối với phân tích thống kê, mỗi lần lấy mẫu được coi là một quan sát độc lập.

C,Độ nhạy là một hàm của phần trăm đột biến (trục x) và tổng số bản sao có thể khuếch đại được sàng lọc (trục y). Ít nhất 5 ng của DNA khuếch đại (~ 1.500 bản) mỗi mẫu được yêu cầu để phát hiện đột biến đáng tin cậy có ở mức 0,2%, tùy thuộc vào tỉ lệ dương tính giả. 87g *, Lặp lại mẫu.

Hình 3. Sàng lọc dòng tế bào, FFPE và các mẫu DNA ngoại bào huyết tương với ddPCR KRAS Screening kit.

A, Biểu đồ 2-D plot của ddPCR KRAS Screening kit áp dụng cho các mẫu DNA dòng tế bào, FFPE DNA và các mẫu DNA ngoại bào từ bệnh nhân từ Trung tâm Ung thư MD Anderson (MDACC; Phòng thí nghiệm Janku);

B,Biều đồ nồng độ của loại hoang dã KRAS (xanh lá), KRAS đột biến (xanh dương) từ sáu mẫu DNA ngoại bào từ huyết tương MDACC

C,Biểu đồ fractional abundance (Tỷ lệ đột biến) với phần trăm đột biến từ sáu mẫu DNA ngoại bào từ huyết tương MDACC, thể hiện phạm vi phát hiện phần trăm đột biến

Hình 4. Phát hiện đa mục tiêu các đột biến KRAS trong 24 mẫu bệnh nhân từ DNA ngoại bào từ huyết tương.

A, Bộ kit phát hiện đột biến KRAS trong 0/12 mẫu plasma bệnh nhân bình thường, 0/7 mẫu huyết tương bệnh nhân không KRAS, và 1/5 mẫu bệnh nhân dương tính KRAS;

B và C, phân tích thêm bằng cách sử dụng duplexed KRAS mutation assays đã xác định mẫu bệnh nhân M3K có đột biến KRAS G13D. Các đối chứng kiểu hoang dã đã được sử dụng với mỗi xét nghiệm để xác định tỷ lệ dương tính giả chính xác cho từng xét nghiệm và các kết quả được tạo ra với các thanh sai số với độ tin cậy 95%. Vì chúng tôi không có đủ mẫu còn lại để sàng lọc tất cả các đột biến riêng lẻ và chúng tôi đã xác định nồng độ tuyệt đối của mẫu, chúng tôi đã sử dụng SsoAdvanced PreAmp Supermix từ Bio-Rad để tạo đủ mẫu để xác định các loại đột biến riêng lẻ. 87g *, Lặp lại mẫu.

Hình 5. DDPCR cho phép trực quan hóa sự ức chế PCR từ các mẫu DNA huyết tương FFPE và ngoại bào.

A, biểu đồ 1-D plot cho phép trực quan hóa và khắc phục sự cố ức chế PCR. Đối với mẫu F3W, chất ức chế có mặt (6 μL), tác động đến biên độ huỳnh quang dương. Tải ít mẫu (2 μL) cho phép khuếch đại tốt hơn.

B, Bất kể tải lượng mẫu, định lượng điểm cuối là như nhau.

Kết luận

• Droplet Digital PCR là một phương pháp tiết kiệm để định lượng tuyệt đối về lượng tối thiểu DNA ngoại bào và FFPE , cho cả sàng lọc và định lượng đột biến
• Lượng bản sao có thể khuếch đại của DNA ngoại bào có sự khác biệt lớn giữa các mẫu từ người bình thường và bệnh nhân ung thư, và giữa các mẫu KRAS hoang dại và KRAS đột biến từ bệnh nhân
• Sử dụng bộ kit của Bio-Rad, chúng tôi đã chứng minh độ nhạy và chính xác trong khả năng phát hiện xuống tới 0,2% cho nhiều đột biến KRAS trong các mẫu DNA ngoại bào từ huyế tương từ bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng
• Bộ kit cho phép sàng lọc số lượng lớn các mẫu bệnh nhân trong một khoảng thời gian tối thiểu
• Dễ dàng trực quan hóa dữ liệu cho phép xác định nhanh chóng hiện tượng ức chế PCR do thiết kế xét nghiệm kém, thuốc ức chế mẫu, điều kiện tối ưu hóa kém hoặc suy thoái mẫu

Truy cập bio-rad.com/ddPCRKRASmutations.để biết thêm thông tin.

Hoặc liên hệ marketing@uscivn.com hoặc Hiep.td@uscivn.com để yêu cầu trao đổi kỹ thuật với chuyên viên tư vấn.