Real-time PCR từ khi ra đời đã được ứng dụng rộng rãi nhờ vào tính tiện lợi và khả năng định lượng mà kỹ thuật PCR thường không thể thực hiện được. Những ưu điểm này xuất phát từ sự vận dụng hiện tượng phát xạ huỳnh quang của một số phân tử hoá học được thiết kế để bắt vào mục tiêu cần phát hiện, từ đó các thiết bị chuyên dụng có thể thu nhận và phân tích tín hiệu để rút ra kết quả định lượng mục tiêu. Tuy nhiên, quá trình ứng dụng hiện tượng quang học này trong kỹ thuật real-time PCR cũng nảy sinh một số vấn đề ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Hãy cùng chúng tôi tìm hiểu giải pháp Universal của Bio-Rad cho những vấn đề này.

Tại sao qPCR cần chất nhuộm tham chiếu?

Khi định lượng nucleic acid bằng kỹ thuật real-time PCR (còn gọi là PCR định lượng hay qPCR), có hai tiêu chí then chốt cần lưu ý là độ chính xác và khả năng lặp lại. Tuy nhiên, những yếu tố bên ngoài như thao tác pipet không đều hay thiết kế của thiết bị (đặc biệt là các thiết bị có độ đồng nhất thấp về nhiệt và quang trong cùng một đĩa phản ứng) có thể dẫn đến những sai lệch trong quá trình đo đạc tín hiệu huỳnh quang.

Thao tác pipet không đều là lỗi do người thực hiện gây ra và thường không thể tránh khỏi, do đó rất dễ để nhận biết. Ngược lại, những vấn đề liên quan đến thiết kế thiết bị, như được mô tả ở hình 1, lại phức tạp hơn. Cụ thể, cách thiết kế bộ phận quang học ở một số hệ thống qPCR khiến cho đường truyền ánh sáng kích thích và ánh sáng phát xạ có sự khác nhau giữa các giếng trên block phản ứng. Những khác biệt về độ dài của đường truyền ánh sáng sẽ tạo ra sai lệch trong kết quả đo cường độ huỳnh quang tuyệt đối giữa các giếng dù chứa cùng một nồng độ chất phát quang. Giếng có đường truyền sáng ngắn hơn (thường nằm ở giữa block nhiệt) sẽ có kết quả đo huỳnh quang cao hơn so với giếng có đường truyền sáng dài hơn (thường nằm cạnh viền block nhiệt).

Hình 1. Đường truyền sáng khác nhau giữa các giếng trong hệ thống qPCR dùng đèn làm nguồn sáng kích thích. Giếng nằm ở tâm block nhiệt có đường truyền sáng ngắn hơn, cho kết quả đo tín hiệu huỳnh quang cao hơn so với giếng nằm cạnh viền block nhiệt có đường truyền sáng dài hơn.

Để giảm tối thiểu tác động của những yếu tố trên, một phương pháp chuẩn hoá tín hiệu trên toàn bộ đĩa phản ứng đã được áp dụng từ rất sớm: sử dụng chất nhuộm tham chiếu trơ (passive reference dye). Chất nhuộm này sẽ được thêm vào master mix trước khi phân phối vào từng giếng phản ứng. Như ý nghĩa của tên gọi “trơ”, chất nhuộm này sẽ không tham gia hay can thiệp vào quá trình nhân bản PCR. Tín hiệu từ chất nhuộm tham chiếu, gọi tắt là tín hiệu tham chiếu (reference signal) sẽ được thu nhận liên tục bằng một kênh màu riêng, song song với tín hiệu phát hiện mục tiêu (target-specific signal) ở các kênh màu tương ứng khác. Mục đích của phương pháp này là sử dụng tín hiệu tham chiếu để chuẩn hoá tín hiệu phát hiện mục tiêu trên toàn bộ đĩa phản ứng, từ đó cải thiện độ lặp lại kết quả định lượng giữa các giếng.

ROX có phải là giải pháp?

ROX, hay 6-corboxy-X-rhodmine, là chất nhuộm tham chiếu trơ được sử dụng phổ biến nhất để chuẩn hoá tín hiệu. Tuy nhiên, mỗi nền tảng thiết bị qPCR có yêu cầu về nồng độ ROX khác nhau (xem Bảng 1), tuỳ thuộc vào đặc điểm nguồn sáng mà thiết bị đó được trang bị. Những thiết bị yêu cầu nồng độ ROX thấp (gọi tắt là thiết bị “low-ROX”) sẽ kích thích chất nhuộm ROX ở bước sóng tối ưu (khoảng 575 nm) nên cho ra tín hiệu ROX mạnh. Những thiết bị yêu cầu nồng độ ROX cao (gọi tắt là thiết bị “high-ROX”) lại kích thích chất nhuộm ROX ở bước sóng không tối ưu (khoảng 488 nm), cho ra tín hiệu ROX yếu, do đó cần nồng độ ROX cao hơn để tăng cường tín hiệu (hình 2A). Trong cả hai trường hợp trên, người dùng hoặc phải tự bổ sung chất nhuộm vào phản ứng hoặc phải cẩn thận chọn mua loại hoá chất phản ứng có pha sẵn ROX sao cho phù hợp với hệ thống qPCR đang sử dụng. Đây là một điểm bất tiện của phương pháp ROX vì kết quả đo có thể bị sai lệch nếu không sử dụng đúng lượng ROX yêu cầu.

Bảng 1. Nồng độ ROX cần dùng trên một số thiết bị qPCR

Bio-Rad cung cấp một dòng các hoá chất qPCR/RT-qPCR Universal được sản xuất theo công nghệ tối tân, đã được cấp bằng sáng chế. Đúng như tên gọi universal (phổ quát), người sử dụng sẽ không còn phải băn khoăn về việc phải lựa chọn các nồng độ chất nhuộm tham chiếu khác nhau phù hợp với từng thiết bị qPCR khác nhau. Mấu chốt nằm ở một lượng hỗn hợp hai chất nhuộm huỳnh quang trơ, gồm chất nhuộm ROX và một chất nhuộm có khoảng chuyển dịch Stoke lớn (long Stoke-shift, viết tắt là LSS), được Bio-Rad phân phối sẵn vào các supermix Universal: khi chạy hoá chất trên một hệ thống bất kỳ, chất nhuộm tham chiếu nào tương thích với hệ thống đó sẽ được kích thích và phát hiện để tạo ra cường độ tín hiệu tham chiếu phù hợp (hình 2B). Khi sử dụng supermix Universal của Bio-Rad trên thiết bị “low-ROX”, chất nhuộm ROX sẽ được kích thích, tạo ra cường độ tín hiệu phù hợp để chuẩn hoá tín hiệu. Khi sử dụng trên thiết bị “high-ROX”, chất nhuộm LSS sẽ được kích thích để sử dụng cho quá trình chuẩn hoá chính xác. Một điểm quan trọng là hai chất nhuộm trơ này được chọn lọc kỹ lưỡng để không xảy ra hiện tượng chồng chéo tín hiệu, tránh gây trở ngại cho quá trình chuẩn hoá tín hiệu và định lượng mục tiêu.

Giải pháp này đem lại khả năng linh hoạt cao: chỉ với một loại hoá chất qPCR, bạn có thể thực hiện phản ứng trên bất kỳ thiết bị qPCR nào. Ngoài những lợi ích như giúp các nhà nghiên cứu không còn phải tìm mua hoặc pha thuốc nhuộm vào phản ứng, cho phép chuẩn bị phản ứng nhanh chóng và hạn chế biến động trong kết quả đo, khả năng này còn tạo điều kiện để tiến hành lặp lại và so sánh kết quả thí nghiệm, kết quả nghiên cứu giữa các hệ thống máy, các phòng thí nghiệm và những người thao tác khác nhau.

Hình 2. Biểu đồ tín hiệu tham chiếu trên hệ thống low-ROX và high-ROX khi chỉ dùng chất nhuộm ROX (A) và khi sử dụng hoá chất Universal của Bio-Rad (B). Kích thích (—); phát xạ (– – –). A, Thiết bị low-ROX kích thích tối ưu chất nhuộm ROX ở bước sóng ~575 nm, cho ra tín hiệu ROX mạnh; ngược lại, thiết bị high-ROX kích thích không tối ưu chất nhuộm ROX ở bước sóng ~488 nm, cho ra tín hiệu ROX yếu. B, Chất nhuộm tham chiếu có sẵn trong hoá chất Universal của Bio-Rad cho phép người dùng linh hoạt sử dụng trên nhiều thiết bị: thiết bị low-ROX sẽ kích thích chất nhuộm ROX, thiết bị high-ROX sẽ kích thích chất nhuộm LSS.

QC - Đảm bảo độ đồng nhất giữa các lô hàng

Sử dụng chất nhuộm tham chiếu để chuẩn hoá tín hiệu giúp cải thiện độ lặp lại của xét nghiệm và giảm các sai số do thiết kế thiết bị gây ra. Tuy nhiên, khi nồng độ chất nhuộm tham chiếu bị dao động, tín hiệu tham chiếu được tạo ra cũng sẽ dao động, ảnh hưởng xấu đến chất lượng dữ liệu qPCR thu được. Ví dụ, khi nồng độ chất nhuộm tham chiếu quá thấp kéo theo tín hiệu thu được nằm gần giới hạn phát hiện dưới của kênh màu, quá trình chuẩn hoá tín hiệu phát hiện mục tiêu có thể xảy ra sai lệch và làm biến đổi kết quả định lượng. Ngược lại, nếu nồng độ chất nhuộm tham chiếu quá cao, quá trình chuẩn hoá tín hiệu phát hiện mục tiêu có thể xảy ra hiện tượng ức chế giả làm tăng giá trị Cq. Nhận thức được tầm quan trọng của độ lặp lại trong xét nghiệm qPCR, Bio-Rad đã triển khai nhiều giải pháp, từ khâu thiết kế đến khâu sản xuất, để đảm bảo chất lượng và độ đồng đều giữa các lô hàng supermix Universal.

Tổng kết

Chất nhuộm tham chiếu trơ là một thành phần thiết yếu trong các sản phẩm supermix qPCR, nhằm hỗ trợ các nhà nghiên cứu thu được kết quả chính xác hơn trên những hệ thống qPCR khác nhau. Với hoá chất Universal của Bio-Rad, các nhà nghiên cứu có thể sử dụng cùng một loại hoá chất phản ứng trên bất kỳ hệ thống qPCR nào mà vẫn thu được kết quả định lượng tối ưu. Điều này sẽ có ý nghĩa lớn đối với độ lặp lại của dữ liệu trong các nghiên cứu trên toàn thế giới.

Hãy xem qua danh mục và tìm hiểu thêm về hoá chất qPCR/RT-qPCR chứa chất nhuộm Universal của Bio-Rad.

Bài viết gốc: https://www.bioradiations.com/one-for-all-the-universal-qpcr-reagent/