GIỚI THIỆU

Vi khuẩn có thể hình thành các cấu trúc dạng màng phủ chặt chẽ gọi là màng sinh học (biofilm), nó hoạt động như một hình thức 'tự bảo vệ' trước các điều kiện môi trường bất lợi. Chiến lược này hỗ trợ tốt cho cả quá trình lây nhiễm lâu dài lên trên bề mặt sinh học, lẫn sự bám tạm thời trên các bề mặt phi sinh học, góp phần làm tăng khả năng sống sót trong môi trường và khả năng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn có khả năng hình thành biofilm hơn so với các vi sinh vật phù du trôi nổi tự do. Việc kiểm soát sự phát triển của các vi khuẩn không mong muốn, đặc biệt là loại có hình thành biofilm, là một thách thức có tầm quan trọng ngày càng cao.

Rất nhiều nghiên cứu đã triển khai để tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học chống lại vi khuẩn. Tuy nhiên, điều quan trọng là phải phân biệt giữa hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính kháng biofilm. Hoạt tính kháng khuẩn ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn và việc ức chế sự tăng trưởng có thể đồng thời dẫn đến ức chế hình thành biofilm. Hoạt tính kháng biofilm thì lại chỉ ảnh hưởng đến sự hình thành biofilm. Vì vậy, việc sử dụng các hợp chất kháng khuẩn ở các nồng độ không thể tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn nhạy thuốc thì thường dẫn đến xuất hiện các chủng kháng thuốc. Ngược lại, các hợp chất kháng biofilm không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn và do đó không tạo ra cơ hội phát triển tính kháng thuốc.

Có nhiều phương pháp để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn hoặc kháng biofilm chống lại vi khuẩn trên đĩa 96 giếng, nhưng cũng có thể xác định cả hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm cùng một lúc. Một ví dụ về điều này là việc đánh giá đồng thời hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm chống lại Salmonella enterica subsp. enterica kiểu huyết thanh Infantis (S. Infantis) sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 600 nm. S.Infantis là một loại vi khuẩn hình roi, kỵ khí tùy ý, gram âm, hình que, thuộc chi Salmonella. Loại Salmonella không gây thương hàn này là một kiểu huyết thanh quan trọng gây nhiễm khuẩn salmonella ở người. Ở động vật, nó gây bệnh phổ biến nhất trên gia cầm và lợn. Việc tăng khả năng kháng kháng sinh và hình thành màng biofilm đặt ra những thách thức lớn trong việc kiểm soát các vi khuẩn này.

Bài viết này mô tả Phương pháp phát hiện đồng thời hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm – sử dụng SPARK máy đọc đĩa đa năng để tạo đường cong tăng trưởng OD600 cho S. Infantis trong đĩa 96 giếng trong khoảng thời gian 20 giờ, cho phép xác định song song hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm của các hợp chất chiết xuất chọn lục bằng nước lạnh từ nấm.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Hệ thống đọc đĩa đa năng SPARK (TECAN)
• S. Infantis (ŽM9; tập hợp dịch nuôi cấy từ Phòng thí nghiệm Vi sinh thực phẩm thuộc khoa Khoa học Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Sinh học; GenBank số đăng ký JARDYW000000000)
• Tryptic soy broth (TSB; Biolife)
• Tryptic soy agar (TSA; Biolife)
• Dịch chiết từ nấm có hoạt tính kháng biofilm (AB)1
• Dịch chiết từ nấm có hoạt tính kháng khuẩn (AM)1
• Đĩa 96 giếng, đáy bằng, nhựa trong

Chủng vi khuẩn được phục hồi từ môi trường nuôi cấy lâu dài bảo quản ở -80°C, và nuôi cấy hiếu khí trên môi trường tăng trưởng ở 37°C. Sau khi ủ qua đêm, dịch nuôi cấy vi khuẩn đã được chuẩn bị bằng cách huyền phù dịch vi khuẩn có độ hấp thụ 0,100 ± 0,010 OD ở bước sóng 600 nm và pha loãng thêm 100 lần trong môi trường tăng trưởng được khuyến cáo có hàm lượng dinh dưỡng gấp đôi để thu được nồng độ cuối cùng là 105 CFU/mL. Dung dịch nuôi cấy đã chuẩn bị và hợp chất đang nghiên cứu được thêm vào từng giếng theo tỷ lệ 1:1, với thể tích cuối cùng là 200 µl. Đĩa nuôi cấy được đậy nắp, quấn parafilm và lắc trong 1 phút với tốc độ 600 vòng/phút trên máy lắc đĩa trước khi ủ trong máy đọc Spark theo quy trình sau:

Bảng 1: SparkControl™ các thiết lập thông số đo để kiểm soát sự tăng trưởng của S.Infantis.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Đường cong tăng trưởng của S. Infantis ŽM9 trong môi trường nuôi cấy có trộn với AB được thể hiện trên Hình 1. Kết quả cho thấy chỉ phần thứ hai của đường cong bị ảnh hưởng bởi dịch chiết hợp chất – sau khi sự phát triển của S. Infantis đã đạt đến pha ổn định. Việc kiểm soát cho thấy độ hấp thụ đo được có sự tăng lên lần thứ hai sau 10 giờ, tương quan với việc sản xuất sinh khối màng biofilm. Không quan sát thấy sự gia tăng thứ cấp trong trường hợp xử lý với 50% AB. Tuy nhiên, hiệu ứng nồng độ được quan sát thấy, với hiệu ứng kháng biofilm cùng dần dần bị vô hiệu hóa ở nồng độ chiết xuất hợp chất là 3,13%.

Hình 1: Đường cong tăng trưởng của S. Infantis trong đĩa 96 giếng với năm nồng độ khác nhau của chiết xuất nấm có hoạt tính kháng biofilm (AB) đã biết. Các đường đứt nét biểu thị giá trị trung bình và các đường liền nét biểu thị độ lệch chuẩn của dữ liệu đo được.

Hình 2 cho thấy đường cong tăng trưởng của S. Infantis ŽM9 trong môi trường nuôi cấy trộn với AM; chỉ có nồng độ cao nhất được thử nghiệm mới ức chế sự tăng trưởng. Hơn nữa, việc pha loãng AM đã kéo dài phase lag, đồng thời ảnh hưởng đến sự gia tăng thứ cấp của đường cong tăng trưởng. Tuy nhiên, dựa trên ảnh hưởng lên đường cong tăng trưởng trong 10 giờ đầu tiên, điều này không nên cho là do hoạt tính kháng biofilm.

Hình 2: Đường cong tăng trưởng của S. Infantis trong đĩa 96 giếng với năm nồng độ khác nhau của chiết xuất nấm có hoạt tính kháng khuẩn (AM) đã biết. Các đường đứt nét biểu thị giá trị trung bình và các đường liền nét biểu thị độ lệch chuẩn của dữ liệu đo được.

Kết quả chứng minh sự phù hợp của máy đọc đa năng Spark để thực hiện phương pháp phát hiện đồng thời hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm. Dữ liệu thu được cho thấy sự khác biệt rõ ràng giữa hoạt chất AB và AM. Hiện tại, các kết quả được giải thích dựa trên sự xuất hiện của đường cong trong tối đa 10 giờ đối với hoạt tính kháng khuẩn và từ 10 đến 20 giờ đối với hoạt tính kháng biofilm. Để đánh giá đường cong tăng trưởng, sử dụng tín hiệu thu được bằng cách đo độ hấp thụ cùng phương pháp phân tích dữ liệu được mô tả trong quy trình.

KẾT LUẬN.

Việc xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm ngày càng trở nên quan trọng trong việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học mới hoặc đánh giá lại hiệu quả hoạt động của các hợp chất có hoạt tính đã biết. Bài viết này trình bày một phương pháp phân tích giúp giảm thời gian đưa ra kết quả bằng cách xác định và phân biệt đồng thời giữa hai kiểu hoạt tính kháng trên vi khuẩn. Dữ liệu thu được bằng máy Spark sẽ tạo cơ sở cho việc phát triển mô hình thân thiện với người dùng để dự đoán hoạt tính kháng khuẩn và kháng biofilm của các hợp chất có hoạt tính sinh học, hỗ trợ xác định kiểu hoạt tính sinh học sẽ tác động lên vi khuẩn.