Tại sao cần chuẩn hóa kết quả western blot?

Chuẩn hóa dữ liệu Western Blot hay Western Blot Normalization là một bước quan trọng trong việc phân tích và đánh giá hàm lượng protein được chuyển màng. Hàm lượng của một hay nhiều protein mục tiêu giữa các mẫu trong cùng một mẻ chạy, dưới các điều kiện thí nghiệm khác nhau, giữa các loại mô, tại các thời điểm hoặc giai đoạn phát triển khác nhau sẽ cùng được so sánh để xác định sự khác biệt. Các nhà nghiên cứu sẽ thực hiện chuẩn hóa kết quả protein để kiểm soát sự biến thiên giữa các mẫu gây ra bởi sai khác trong thực nghiệm, ví dụ như trong bước chuẩn bị mẫu, tải mẫu, chuyển màng, để tránh đưa ra một ngộ nhận hay một kết quả bị sai lệch. Mục tiêu trước nhất của việc chuẩn hóa dữ liệu western blot là đảm bảo rằng kết quả cuối cùng được đưa ra sẽ phản ánh chính xác sự khác nhau giữa các mẫu.

Hai phương pháp chính để chuẩn hóa kết quả Western Blot

Khi chuẩn hóa dữ liệu Western Blot phục vụ việc đánh giá kết quả, có hai phương thức chính thường được sử dụng: thứ nhất là dùng Housekeeping Protein (HKP) như một đại lượng kiểm soát việc chuẩn hóa; thứ hai là sử dụng phương pháp chuẩn hóa dựa trên protein tổng số (Total protein normalization, TPN)

Housekeeping proteins là những protein có mặt ở khắp mọi nơi và biểu hiện nhất quán ở tất cả các mẫu. Nó đóng vai trò như một chuẩn nội (internal standard) chứ không phải là protein mục tiêu. Nhờ vào bản chất của HKP, các kháng thể nhận biết chúng có sẵn và việc phát hiện các protein này rất dễ dàng. Các HKP thường được sử dụng là: Beta-actin, Tubulin, GADPH. Những protein này thường biểu hiện mức độ cao do có vai trò quan trọng với tế bào sống. Mặc dù được sử dụng phổ biến, nhưng phương pháp này tồn tại rất nhiều hạn chế, có thể kể đến như: HKP có mức biểu hiện thay đổi theo điều kiện thí nghiệm và biểu hiện khác nhau giữa các loại tế bào cũng như giữa các giai đoạn phát triển của tế bào; ngoài ra, HKP có biểu hiện cao cũng sẽ gây khó khăn cho việc phát hiện các protein mục tiêu có biểu hiện thấp. Thêm vào đó là những yêu cầu kỹ thuật cần thiết như: chứng âm và chứng dương phải thiết lập tách biệt nhau sao cho chứng âm không biểu hiện HKP và chứng dương thì có biểu hiện HKP; phải xác thực mức biểu hiện của housekeeping protein có như nhau giữa các mẫu hay không đòi hỏi sự lặp lại và gây tốn kém thời gian. Thậm chí việc sử dụng HKP để chuẩn hóa còn gia tăng sự phức tạp khi phải thêm bước gắn mẫu dò (là các kháng thể nhận biết HKP) lên màng, có khả năng gây biến thiên kết quả.

Sự biến thiên về mức độ biểu hiện của các Housekeeping Protein xuyên suốt quá trình phát triển của võng mạc chuột.(Nguồn: Rocha-Martins et al. PLoS ONE 7(8): e43028 (2012). doi:10.1371/journal. pone.0043028)

Những lý do trên chính là "nguồn cơn" của việc tìm kiếm một cách chuẩn hóa kết quả Western Blot mà không cần sử dụng housekeeping protein để chuẩn hóa. Yêu cầu này hoàn toàn được đáp ứng bằng cách sử dụng phương pháp chuẩn hóa kết quả Western Blot bằng protein tổng số (TPN). Khi tiến hành chuẩn hóa Western Blot theo phương pháp protein tổng số, tất cả các protein trong một mẫu được hiển thị và sự dồi dào của chúng đóng vai trò là cơ sở của việc chuẩn hóa. Màng lai sẽ được ủ với thuốc nhuộm protein tổng số (có thể thực hiện trước hoặc sau khi nhận diện  protein bằng kháng thể), điển hình là thuốc nhuộm Coomassie Blue. Hàm lượng protein mục tiêu sẽ được chuẩn hóa trên lượng protein tổng số có trong mỗi mẫu. Phương pháp TPN hoàn toàn phù hợp với protein có biểu hiện thấp hoặc tồn tại ở hàm lượng thấp trong mẫu.

Nhuộm Protein tổng số với Coomassie Blue là một thước đo chính xác đối với lượng protein được tải nạp.

(Nguồn: Eaton et al. doi:10.1371. journal.pone.0072457)

Phương pháp TPN hiện nay vẫn được áo dụng rất rộng rãi, mặc dù vậy, bước nhuộm TPN với Coomassie Blue vẫn chưa phải là phiên bản "tối tân" nhất của ngành khoa học sự sống trong việc chuẩn hóa dữ liệu protein.  Để khám phá thêm về thứ "vũ khí tối tân" mạnh mẽ và mới mẻ hơn đó, các bạn hãy cùng đón đọc tiếp Phần 2 trên https://unitedscientific.com.vn nhé!

(Còn tiếp)